Chromatografia żelowa (wykluczania) GPC/SEC

Chromatografia wykluczania (GPC/SEC) jest techniką analityczną pozwalającą na charakteryzację cząsteczek na podstawie ich wielkości. Kolumna chromatograficzna wypełniona porowatym żelem połączona jest z zestawem detektorów. Podczas przepływu próbki przez kolumnę, zawarte w niej małe cząsteczki łatwo wnikają w głąb porów i dłużej się w nich znajdują, wydłużają czas retencji w stosunku do cząsteczek większych, którym do porów wniknąć jest trudno.

Wyznaczanie masy cząsteczkowej w technice GPC/SEC może odbywać się na kilka sposobów. Najbardziej popularny z nich to tak zwana kalibracja konwencjonalna, do której wystarczające jest jeden detektor stężeniowy. W tej technice konieczne jest utworzenie krzywej kalibracyjnej na podstawie wzorców o znanej masie cząsteczkowej. Masa badanej próbki jest następnie odczytywana przez porównanie jej czasu retencji z krzywą wzorcową. Metoda ta mimo swojej popularności jest obarczona dość poważną wadą – w związku z tym, że separacja w GPC/SEC jest związana z wielkością makrocząsteczki a nie z jej masą zastosowanie wzorca, który chemicznie jest inny niż badana próbka może prowadzić do błędnych wniosków. Różne chemicznie cząsteczki mimo takiej samej wielkości (a zatem też czasu retencji) mogą mieć różną masę o czym kalibracja konwencjonalna nic nie powie.

Alternatywą jest zastosowanie zaawansowanej detekcji. Jeżeli do układu podłączymy dodatkowo detektor wiskozymetryczny możemy zastosować tak zwaną kalibrację uniwersalną. Detektor wiskozymetryczny mierzy lepkość graniczną będącą odwrotnością gęstości. W tej metodzie nadal konieczne jest utworzenie krzywej kalibracyjnej ale jest to krzywa łącząca czas retencji nie z masą tylko z objętością cząsteczki (mnożymy masę przez odwrotność gęstości). Podczas pomiaru próbki z krzywej wzorcowej odczytujemy jej objętość, która następnie jest przeliczana na masę przy użyciu zmierzonej wartości lepkości granicznej. Wynik z kalibracji uniwersalnej nie jest obarczony błędami wynikającymi z budowy cząsteczek. Nadal jednak konieczne jest czasochłonne utworzenie krzywej kalibracyjnej.

W przypadku zastosowania detektora statycznego rozpraszania światła nie trzeba tworzyć krzywej kalibracyjnej. Masa wyznaczana jest bezpośrednio z sygnału detektora a wynik nie jest zależny od struktury przestrzennej cząsteczki. Współczesne detektory statycznego rozpraszania światła są w stanie wyznaczać masy tak niskie jak 200 Da co sprawia, że stają się coraz bardziej powszechną alternatywą dla kalibracji konwencjonalnej.

Zastosowanie na wyjściu z kolumny zestawu składającego się z detektora stężeniowego (najczęściej RI), detektora rozpraszania światła i wiskozymetrycznego nosi nazwę potrójnej detekcji i pozwala na jednoczesne określenie takich parametrów jak bezwzględna masa cząsteczkowa, rozmiar cząsteczki czy lepkość graniczna. Na tej podstawie można wyciągnąć wnioski na temat makromolekularnej struktury, konformacji, agregacji i rozgałęzienia cząsteczek w próbce. Jeżeli dołączymy drugi detektor stężeniowy (najczęściej UV) mamy do czynienia z poczwórną detekcją pozwalającą dodatkowo wychwytywać także pewne różnice chemiczne czy też analizować budowę kopolimerów.

Dzięki chromatografii wykluczania (żelowej) można:

• Badać procesy oligomeryzacji, agregacji i łączenia białek
• Kontrolować wytrzymałość, twardość i zachowanie polimerów
• Przewidywać właściwości i zachowanie produktów farmaceutycznych takich jak krople do oczu
• Badać jakość produktów spożywczych

Zastosowania chromatografii wykluczania GPC/SEC

W branży polimerowej chromatografia wykluczania jest jednym z podstawowych narzędzi. Dzięki chromatografii żelowej możliwe jest uzyskanie informacji o rozkładzie masy cząsteczkowej, której wielkość wpływa na właściwości polimeru. Ponadto system GPC z wielokrotną detekcją pozwala uzyskiwać dodatkową wiedzę na temat struktury, konformacji i rozgałęzień polimeru, przez co umożliwia lepsze zrozumienie zachowania wytworzonych materiałów.

W badaniach białek chromatografia wykluczania pozwala określić skład oligomeryczny próbki, a także pomaga zrozumieć mechanizm agregacji. Chromatografia żelowa (filtracja żelowa) pozwala na rozdział poszczególnych form oligomerycznych i określenie ich masy cząsteczkowej oraz konformacji cząsteczki lub struktury powstałych agregatów.